Sistem Terintegrasi untuk Pemantauan dan Visualisasi Sel Hidup Secara Stabil dalam Penelitian Imunologi Menggunakan Celloger Mini Plus

Gambar 1. Keunggulan Penggunaan Celloger® dalam Pencitraan Sel Suspensi

Sel darah putih merupakan sel suspensi yang berperan dalam sistem imun, sehingga banyak digunakan dalam penelitian imunologi. Berbeda dengan sel adheren, sel suspensi mudah bergerak akibat pergeseran pelat serta perubahan suhu dan CO₂, sehingga sulit dipantau secara real-time menggunakan mikroskop konvensional. Oleh karena itu, diperlukan sistem live cell imaging seperti Celloger® yang beroperasi di dalam inkubator untuk memastikan pemantauan sel yang lebih stabil.¹ Pada Celloger® Mini Plus, kamera bergerak untuk menangkap citra sel dari berbagai posisi tanpa menggeser plate sampel, sehingga kondisi sel tetap stabil. Hasil pemantauan menunjukkan pencitraan yang lebih stabil dan fokus dibandingkan mikroskop konvensional (Gambar 1).

Pada pencitraan sel suspensi menggunakan mikroskop inverted (gambar kiri), kestabilan posisi sel sulit dipertahankan karena sampel harus dikeluarkan dari inkubator dan plate digerakkan untuk mengamati berbagai posisi. Kondisi ini menyebabkan sebagian sel terangkat dari dasar plate dan kehilangan fokus. Sebaliknya, Celloger® Mini Plus (gambar kanan) memungkinkan pencitraan dilakukan langsung di dalam inkubator dengan plate yang terpasang stabil, sementara kamera bergerak untuk mengakuisisi citra dari berbagai posisi. Mekanisme ini meminimalkan pergerakan sel dan menjaga fokus selama pengamatan.

Sel darah putih merupakan komponen penting dalam sistem imun yang berfungsi melawan infeksi serta melindungi tubuh dari paparan benda asing. Sebagai garis pertahanan pertama, imunitas bawaan (innate immunity) memberikan respons inflamasi secara cepat untuk membatasi penyebaran patogen di dalam tubuh. Aktivasi imunitas bawaan berlangsung dalam beberapa jam dan memicu respons inflamasi yang cepat. Oleh karena itu, pemantauan berbagai aktivitas pertahanan seluler secara real-time menjadi penting. Salah satu mekanisme utamanya adalah perekrutan sel imun menuju area infeksi. Dalam proses ini, monosit bermigrasi ke jaringan dan berdiferensiasi menjadi makrofag yang berperan dalam melawan patogen melalui mekanisme fagositosis. Pengamatan sel secara real-time menggunakan Celloger® Mini Plus dilakukan pada cell line RAW264.7 yang memiliki karakteristik fungsional makrofag dan menunjukkan respons terhadap stimulasi lipopolisakarida (komponen penyusun membran luar bakteri Gram-negatif). Proses visualisasi menggunakan channel brightfield dan fluoresensi hijau dengan lensa objektif 10X.²

Setelah distimulasi dengan LPS, sel RAW264.7 menunjukkan peningkatan jumlah sel dengan perubahan morfologi. Sel yang semula berbentuk bulat, tebal, dan melekat longgar pada permukaan plate secara bertahap menyebar, melekat lebih kuat, serta berubah menjadi bentuk memanjang menyerupai gelendong (spindle-shaped). Perubahan ini dipantau menggunakan Celloger Mini Plus dengan objektif 10× melalui pengambilan citra setiap 15 menit.

Gambar 2. Pemantauan Perubahan Morfologis pada sel Raw264.7 dengan LPS

Penelitian Saxena et al. (2003) menunjukkan bahwa stimulasi LPS dapat mendorong sel RAW264.7 berdiferensiasi menjadi sel dengan karakteristik menyerupai sel dendritik (dendritic-like cells).³ Pemantauan real-time menggunakan Celloger® Mini Plus memperlihatkan bahwa sel yang diberi perlakuan LPS memiliki perlekatan lebih kuat serta bentuk yang lebih lebar dan pipih dibandingkan sel tanpa perlakuan LPS (Gambar 2). Perubahan morfologi ini tampak lebih jelas pada 11 jam setelah stimulasi dan bertahan hingga 22 jam. Selain itu, LPS juga memicu proliferasi sel, yang diukur secara kuantitatif menggunakan fitur confluency analysis pada Celloger® (Gambar 3).

Gambar 3. Kurva Pertumbuhan Sel yang Distimulasi LPS Berdasarkan Hasil Analisis Konfluensi

Pengambilan citra sel secara time-lapse menggunakan Celloger® Mini Plus (objektif 10X), yang dilanjutkan dengan analisis konfluensi melalui aplikasi “Celloger® Mini Plus Analysis”, memungkinkan pemantauan pertumbuhan sel dalam bentuk kurva pertumbuhan.

Aktivasi makrofag oleh LPS diketahui dapat meningkatkan aktivitas fagositosis melalui jalur Toll-like receptor 4 (TLR4)._­^2,4 Untuk mengamati proses ini secara real-time, digunakan fluorescent latex beads berukuran 2 µm sebagai partikel yang akan ditelan oleh makrofag. Namun, beads yang mudah bergerak dan mengapung di atas permukaan plate dapat menghambat penyerapan oleh sel serta menyulitkan proses pencitraan. Berbeda dengan metode uji fagositosis konvensional yang memerlukan pencucian pada tahap akhir untuk menghilangkan beads yang tidak tertelan,^5,6  Celloger® memungkinkan proses fagositosis diamati secara langsung. Hasilnya menunjukkan bahwa penelanan beads terjadi pada makrofag yang teraktivasi LPS dan mengalami perubahan morfologi menjadi lebih pipih serta menyebar (Gambar 4A). Perilaku sel yang telah teraktivasi tersebut diduga berkaitan dengan perubahan bentuk menjadi memanjang menyerupai gelendong (spindle-shaped), sehingga memungkinkan sel bergerak lebih terarah menuju beads dibandingkan saat masih berbentuk bulat dan menyerupai kubus. Selain itu, pemantauan real-time menunjukkan bahwa setelah menelan beads, sel membagikan partikel tersebut ke sel anak bersama dengan pembagian sitoplasmanya saat proses pembelahan berlangsung (Gambar 4B).

Gambar 4. Proses Fagositosis Sel RAW264.7 yang Distimulasi LPS, Diamati Menggunakan Celloger Mini Plus (Kanal Brightfield dan Fluoresensi Hijau, Objektif 10X)

Karakteristik khusus fluorescent probe memungkinkan pemantauan berbagai proses dinamis dalam lingkungan molekuler sel. Kombinasi fluorescent dye dengan pencitraan brightfield dapat memberikan informasi tambahan untuk penelitian yang lebih mendalam. Salah satu penerapannya adalah penggunaan cell-impermeant nucleic acid stain, yaitu dye yang tidak dapat menembus membran sel dalam kondisi utuh, tetapi dapat masuk ketika integritas membran terganggu. Hal ini memungkinkan evaluasi sitotoksisitas dengan mendeteksi kerusakan membran selama apoptosis.⁷ Pada neutrofil, pewarnaan asam nukleat juga dapat dimanfaatkan untuk mendeteksi pembentukan NET (neutrophil extracellular traps),⁸ yaitu struktur menyerupai jaring yang tersusun dari DNA dan protein antimikroba untuk menangkap patogen. Selain itu, produksi reactive oxygen species (ROS) di dalam sel dapat dikuantifikasi menggunakan dye yang bereaksi dengan ROS,⁹ sedangkan perubahan keasaman intraseluler selama proses endositosis dan fagositosis dapat diamati menggunakan pH-sensitive dye.¹⁰

Penggunaan Celloger® Mini Plus untuk live cell imaging memungkinkan pengambilan citra sel beresolusi tinggi tanpa menimbulkan gangguan fisik, seperti kerusakan atau guncangan pada sel. Sistem otomatis ini dapat beroperasi langsung di dalam inkubator sehingga tidak memerlukan pemindahan perangkat keluar-masuk inkubator. Berbeda dari perangkat lain, Celloger® Mini Plus tidak menggunakan movable stage, melainkan menggerakkan kamera di dalam sistem untuk mengambil citra sel dari berbagai posisi. Dengan posisi wadah kultur dan sampel sel yang tetap stabil, kondisi pertumbuhan sel lebih terjaga sehingga mendukung keberhasilan penelitian berbasis sel. Selain kompatibel dengan berbagai jenis wadah kultur, sistem ini memiliki reproduksibilitas posisi yang tinggi untuk memastikan pemindaian multi-point yang stabil dan menghasilkan data yang andal dalam penelitian imunologi.

1. Awasthi, B. P., Chaudhary, P., Guragain, D., Jee, J. G., Kim, J. A., & Jeong, B. S. (2021). Synthesis and anti-hepatocellular carcinoma activity of aminopyridinol–sorafenib hybrids. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 36(1), 1884–1897. https://doi.org/10.1080/14756366.2021.1953997.
2. Wu, T. T., Chen, T. L., & Chen, R. M. (2009). Lipopolysaccharide triggers macrophage activation of inflammatory response through a toll-like receptor 4/myeloid differentiation factor 88-dependent mechanism in the presence of extracellular calcium. Toxicology Letters, 191(2-3), 195–202.
3. Saxena, R. K., Vallyathan, V., & Lewis, D. M. (2003). Evidence for lipopolysaccharide-induced differentiation of RAW264.7 murine macrophage cell line into dendritic-like cells. Journal of Biosciences, 28(1), 129–134.
4. Taciak, B. et al. (2018). Evaluation of phenotypic and functional stability of RAW 264.7 cell line through serial passages. PLoS ONE, 13(6), e0198943. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0198943Ariganello, Marianne B., et al. (2018) International journal of nanomedicine.
5. Ariganello, M. B., Guadarrama Bello, D., Rodriguez-Contreras, A., Sadeghi, S., Isola, G., Variola, F., & Nanci, A. (2018). Surface nanocavitation of titanium modulates macrophage activity. International Journal of Nanomedicine, 13, 8297–8308.
6. Manda‐Handzlik, A., et al., 2018. Immunology and Cell Biology, 96(4), pp.413-425. Google Schola
7. Riss, T. L., Moravec, R. A., Niles, A. L., Duellman, S., Benink, H. A., Worzella, T. J., & Minor, L. (2019). Cell Viability Assays. Dalam S. Markossian et al. (Eds.), Assay Guidance Manual [Internet].
8. Takishita, Y., Yasuda, H., Shimizu, M., Matsuo, A., Morita, A., Tsutsumi, T., Tsuchiya, M., & Sato, E. F. (2020). Formation of neutrophil extracellular traps in mitochondrial DNA-deficient cells. Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition, 66(1), 15–23.
9. Samui, A., Pal, K., Karmakar, P., & Sahu, S. K. (2019). In situ synthesized lactobionic acid conjugated NMOFs, a smart material for imaging and targeted drug delivery in hepatocellular carcinoma. Materials Science and Engineering: C, 98, 772-781. [1, 2]Diwu, Zhenjun, et al. (1999) Chemistry & biology.
10. Diwu, Z., Chen, C. S., Zhang, C., Klaubert, D. H., & Haugland, R. P. (1999). A novel acidotropic pH indicator and its potential application in labeling acidic organelles of live cells. Chemistry & Biology, 6(7), 411-418.