Pemilihan Penggunaan Kolom pada HPLC
Pemilihan kolom pada HPLC sangat penting sebelum analisis senyawa menggunakan HPLC, dikarenakan kolom merupakan jantung dari HPLC itu sendiri, jika pemilhan salah akan berdampak pada hasil analisis yang dilakukan. bebeapa hal yang perlu diperhatikan dalam pemilihan kolom pada HPLC
- Pemilihan ukuran pori fasa diam
Jika analit yang akan dianalisis memiliki berat molekul < 3000 Da maka gunakan ukuran pori partikel yang kecil ( 60-120 Å), untuk analit yang memiliki berat molekul >3000 Da maka gunakan ukuran pori partikel 3000 Å.
- Pemilihan ukuran partikel
Ukuran partikel yang umum digunakan untuk HPLC yaitu 5 µm, 3 ,5 µm, atau lebih kecil, pemilihan ukuran partikel yang lebih kecil ( 1,8 µm, atau 2-3 µm) digunakan jika metode analisis dengan system high speed.
Pemilihan panjang kolom yang lebih pendek dengan ukuran partikel yag lebih kecil akan memberikan resolusi pemisahan lebih baik, namun membutuhkan pompa yang lebih besar.
hal ini dikarenakan ukuran partikel yang lebh kecil, memberikan ruang yang sangat padat , ketika proses pemisahan berlangsung dibutuhkan pompa yang lebih besar untuk menarik solvent untuk melewati kolom
- Material penyusun fasa diam
Ada beberapa jenis material yang menyusun fasa diam,
- Base material /silica
Material jenis kolom ini terbuat dari material silica berpori, namun material ini memiliki kelemahan yaitu gugus silanol pada silica sangat mudah mengalami reaksi reduksi pada suasana asam dan basa, dimana gugus silanol lepas yang menyebabkan kolom tidak memilik kemampuan untuk interaksi (tidak terjadi pemisahan).
- Bonded Phase Silica
Adanya kekurangan pada jenis material silica kolom , dapat diatasi dengan mereaksikan gugus silanol dengan senyawa organic (ex: octadecylsilane (ODS)) , sehingga gugus silanol tersubstitusikan seluruhnya oleh ODS.
Namun jenis kolom ini masih tidak tahan jika analisis dilakukan pada pH ekstrim, dimana pH dapat menghidrolisis ikatan antara silanol dengan ODS
- Polymers
Material polymer pada kolom dapat digunakan ketika proses analisis kondisinya mensyaratkan pada pH sangat asam atau sangat basa, dimana pada keaadaan tersebut kolom jenis silica tidak dapat bekerja maksimal.
- Fasa Gerak
Pemilihan penggunaan kolom berhubungan dengan fase gerak yang digunakan, baik jenis maupun komposisi. Pemilihan fase gerak penting dalam proses pemisahan pada matrik yang bersifat komplek. Jika mode yang digunakan HPLC fase terbalik, maka penggunaan fase gerak merupakan pelarut organic termodifikasi ( hidro-organik). selain itu,komposisi fase gerak dan jenis senyawa yang akan ditentukan berpengaruh pada selektivitas dan waktu retensi
- pH
pH maupun kekuatan ion merupakan hal penting dalam fase gerak,dimana pH menentukan kehandalan/daya tahan suatu metode yang dikembangkan,. Suatu metode seharusnya tahan terhadap pH dalam jumlah kecil. Namun, untuk senyawa yang bersifat dapat terionisasi perubahan pH sangat berpengaruh terhadap waktu retensi.
